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熒光顯微鏡簡介：
熒光顯微鏡是光學顯微鏡的一種特殊形式。 它利用熒光染料被一定波長的光激發后發光的能力。 感興趣的蛋白質可以通過抗體染色或用熒光蛋白標記用這種熒光染料進行標記。 它允許確定單個分子種類的分布、其數量及其在細胞內的定位。 此外，可以進行共定位和相互作用研究，使用可逆結合染料觀察離子濃度，例如 觀察到 Ca2+ 和 fura-2，以及內吞作用和胞吐作用等細胞過程。 今天，甚至可以借助熒光顯微鏡對亞分辨率粒子進行成像。

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斯托克斯頻移
熒光的一個重要特征是斯托克斯頻移。它描述了激發光子和發射光子的能級差異。熒光染料發射的光子比激發光子具有更大的波長。這是由于在熒光染料被激發之后但在其發射光子之前向周圍環境釋放能量。由此產生的波長偏移使得區分激發光和發射光成為可能。能量的吸收和發射可以看作是分子種類的特定特征。

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熒光顯微鏡
熒光顯微鏡（正置或倒置）類似于普通光學顯微鏡，不同之處在于照明由激光作為單色光或明亮且強大的光源（如汞蒸汽或氙弧燈）提供。此外，它還包含一個激發濾光片和一個發射濾光片。激發濾光片僅傳輸能夠用其特定染料激發樣品的光。樣品發出的光在到達檢測器之前必須通過發射濾光片。發射濾光片僅對具有不同波長的光是半透明的，例如樣品發出的光。

1. 熒光顯微鏡的光通路

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近年來，LED（發光二極管）也被用作熒光顯微鏡的光源。 LED 發出的光的波長取決于用于生產的材料。 然而，在大多數情況下都需要激發濾光片，因為 LED 通常會在相當寬的波長范圍內發光。
大多數熒光顯微鏡是落射熒光顯微鏡。 照明器和物鏡位于樣品的同一側，光線不會穿過樣品。 除了激發和發射濾光片外，這種熒光顯微鏡還需要一個分色鏡。 分色鏡允許特定波長的光通過，而其他波長的光被反射。 濾光片和分色鏡通常一起插入濾光片立方體中。

2. 濾波器原理

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激發光通過激發濾光片并被引導至分色鏡。這會將通過物鏡的光反射到樣品上。樣品中的熒光染料被激發并發射光子。該發射光通過物鏡返回到分色鏡。發射的光具有適當的波長并且能夠通過。被試樣反射的激發光不能通過分色鏡，會被擋住。如果激發光能夠通過二向色鏡，它會在到達發射濾光片時被阻擋。可以用檢測器測量通過發射濾光片的光。
熒光顯微鏡中使用了不同類型的濾光片。可以區分帶通、長通和短通濾波器。帶通濾光片傳輸一個波長帶，而波長更大或更小的光將被阻擋。長通和短通濾波器是邊緣濾波器。長通濾光片傳輸長波長的光。波長高于某個截止值的光將無法通過。相反，短通濾光片傳輸短波長并阻擋長波長。

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不同的熒光顯微鏡中技術
熒光顯微鏡被廣泛使用并提供了很好的特異性。各種技術可以解決不同的問題，甚至可以繞過 Ernst Abbe 描述的衍射極限。
分子種類的定位可以通過細胞器的共染色來確定，例如細胞器。細胞骨架或細胞膜。共焦激光掃描顯微鏡 (CLSM) 可以在沒有來自焦平面外部的信號的情況下觀察樣本中的區域，并允許進行光學切片。全內反射 (TIRF) 顯微鏡是一種允許觀察靠近細胞表面的薄區域的技術。漸逝場激發該區域的熒光染料。
一種觀察分子種類動力學的技術是光漂白后的熒光恢復 (FRAP)。限制區域中的熒光染料被光漂白，并且可以測量未漂白分子擴散到該區域中的情況。可以使用熒光能量轉移 (FRET) 顯微鏡進行相互作用研究。激發的供體生色團可以將能量轉移到受體熒光染料并激發它。這只有在兩者非常緊密地結合在一起時才有可能。如果這些染料與不同的蛋白質偶聯，它們只有在蛋白質相互作用時才能傳遞能量并發出熒光。
允許亞分辨率圖像的技術是受激發射耗盡 (STED) 顯微鏡、基態耗盡 (GSD) 顯微鏡、單分子和基態耗盡顯微鏡，然后是單個分子返回 (GSDIM)，以及光激活定位顯微鏡 (PALM) 和隨機光學重建顯微鏡（STORM）。用于這些技術的亞分辨率顯微鏡也被稱為納米顯微鏡，因為它們在納米尺度上解析圖像。

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5.Pukinje細胞，小鼠小腦皮質的三重標記旁矢狀切面。 紅色：anti-calbindin-D28k/Cy3，綠色：anti-GFAP/Cy5，藍色：Hoechst 33258

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